RESUMO
In the absence of validated biomarkers to control the cure of Chagas disease, PCR-based diagnosis is being used as the main tool for an early indication of therapeutic failure. However, since it is considered a technique of complex reproducibility, mainly due to difficulties in establishing accurate controls to guarantee the quality of the reaction, the use of PCR for Chagas disease diagnosis is restricted to specialized centers. In an effort to disseminate the molecular diagnosis of Chagas disease and its applications, new diagnostic kits based on qPCR have been made available in the market in recent years. Here, we show the results of the validation of the NAT Chagas kit (Nucleic Acid Test for Chagas Disease) for the detection and quantification of T. cruzi in blood samples of patients suspected of Chagas disease infection. The kit, composed of a TaqMan duplex reaction targeting the T. cruzi satellite nuclear DNA and an exogenous internal amplification control, presented a reportable range from 104 to 0.5 parasite equivalents/mL and a limit of detection (LOD) of 0.16 parasite equivalents/mL of blood. In addition, the NAT Chagas kit detected T. cruzi belonging to all six discrete typing units (DTUs-TcI to TcVI), similarly to the in-house real-time PCR performed with commercial reagents, which has been selected as the best performance assay in the international consensus for the validation of qPCR for Chagas disease. In the clinical validation presented here, the kit showed 100% sensitivity and 100% specificity when compared to the consensus in-house real-time PCR assay. Thus, the NAT Chagas kit, which is produced entirely in Brazil under the international standards of good manufacturing practices (GMP), appears as an excellent alternative to enable the molecular diagnosis of Chagas disease in public and private diagnostic centers, as well as to facilitate the monitoring of patients under etiological treatment participating in clinical trials.
RESUMO
O desenvolvimento e a produção de vacinas virais, de uma forma geral, envolvem diversas etapas que necessitam do monitoramento da carga viral ao longo de todo processo. Essas etapas vão desde a produção do antígeno, purificação, inativação, liofilização, testes pré-clínicos e clínicos e uma vez o produto licenciado, um processo de farmacovigilância contínuo se faz necessário. Atualmente em Biomanguinhos essas etapas são monitoradas pelo ensaio de titulação em placa de lise que leva em torno de sete a dez dias. Com o recente desenvolvimento do qRT-PCR em tempo real (qRT-PCR), temos disponível uma abordagem mais rápida para este monitoramento, que pode ser feito em poucas horas. Dentro deste contexto, desenvolver, padronizar e validar uma técnica que permita quantificar o vírus da febre amarela de forma rápida e eficaz em todas as etapas acima descritas é de extrema importância na otimização deste processo. Para tal foi construída uma curva padrão plasmidial e parâmetros como linearidade, precisão intermediária e especificidade foram avaliados. Além disso, foi definido o limite de detecção e quantificação do teste. Para garantir a qualidade do teste foram estabelecidos controles exógenos e endógenos, a fim de evitar resultados falso negativos. A análise estatística dos dados de quantificação viral, nos revelam uma excelente correlação entre os resultados obtidos em cópias de RNA/mL quantificados por qRT-PCR e o título viral calculados em ensaios de plaque (R = 0.96), além da obteção de um fator de correlação, para conversão dos valores de PCR em tempo real para plaque. A análise dos resultados demonstrou que os experimentos da validação atendem a todos os parâmetros definidos pelo setor de qualidade. Esta técnica se mostrou eficiente para determinação da carga viral do vírus da febre amarela tanto em amostra in vivo quanto in vitro, tornando-se assim uma ferramenta muito importante em todos os projetos desenvolvidos no LATEV e podendo inclusive, no futuro ser adotada como padrão ouro nas análises laboratoriais e de controle de qualidade dos lotes vacinais.
